Chang
Gung University Transgenic Mouse Core Laboratory (TMCL) Guideline
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實驗室主持人：歐陽品主任 連絡人：胡智偉 3171, 5008 |
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服務項目： A.原核顯微注射（Pronuclei
microinjection） B.胚胎幹細胞之基因標的（ES
cell gene targeting） D. 胚胎冷凍（Embryo cryopreservation） E.諮詢以下事項： 1. 載體之構築（Gene
vector construction） 2. 轉殖基因載體構築及製備（Preparation
of constructs） 3. 基因轉殖小鼠及基因標的小鼠之飼育及繁殖（Maintenance
of transgenic/ gene-targeted mouse lines） 4.
基因轉殖小鼠及基因標的ES
cell 鑑別（Identification of
transgenic founder mice and correctly targeted ES clones） 不提供以下服務項目 A.載體及轉殖基因之提供及其製備 B.基因轉殖小鼠之鑑別 C.基因標的ES
cell之鑑別 D.基因轉殖小鼠及基因標的小鼠品系之代養及繁殖 E.個案結束後之小鼠胚胎儲存 使用規則 A. 基因轉殖鼠核心實驗室（Transgenic
Mouse Core Laboratory）以下簡稱TMCL，將從10/1/2002起接受長庚系統之委託，生產基因轉殖及基因標的小鼠及提供其它相關服務。 B. TMCL之收費將由長庚基因轉殖鼠使用委員會（Chang Gung Transgenic Mouse Use Committee）討論決定，並隨時視需要由委員會修改之。 C. 委託個案依收件日期先後順序及數量為個案進行先後之依據；同一申請人提出一個以上之個案申請，若之後有其它申請個案則以穿插方式進行。收到申請表後TMCL人員會與申請人做進一步的確認。若有其它例外事項，需調動進行之順序時，則由委員會協調後決定。 D. 轉殖基因之來源、背景、轉殖基因之構築圖譜；以及欲轉殖基因之小鼠品系等均應詳細填寫於申請表上，以利TMCL人員與申請者間之溝通。 E. 為增進TMCL之執行效率，申請人應詳讀TMCL之申請須知，轉殖基因之製備必須符合TMCL之規定。若轉殖基因之質與量不符要求，將予退件，個案進行之時程亦將因此延遲。若屢次不符則取消委託。 F. TMCL只使用健康狀況良好及不帶有特定病原菌（SPF）之動物，且飼育於長庚實驗動物中心無特定病原區內。TMCL不負責個案結束後之動物健康狀況。
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原核顯微注射（Pronuclei microinjection） A.
事前準備：在申請基因轉殖實驗前，必須先瞭解以下事項。 1.已完成轉殖基因之構築。 2.已確立有效篩選轉殖基因之方法。（如PCR, Southern blot） 3.有足夠的動物房空間可供基因轉殖小鼠繁殖。 4.瞭解基因轉殖之特性，例如有些基因受限於其自然特性，無法獲得基因轉殖小鼠。 B.
小鼠品系：TMCL提供純品系FVB/N及純品系C57/B6小鼠為主要對象。其它品系則暫不提供。 C.
已構築完成之質體必須可以利用常用的限制鋛酵素處理後，分成轉殖基因及載體等兩個以上之片段。為避免各片段間之污染，每一片段必須相差1Kb以上 D.
為使基因轉殖之效率提高，以下幾點請遵守： 1.
製備完成之轉殖基因質體儲存，不可超過兩週以上。 2.
構築完成之質體請勿先行以限制鋛酵素處理後儲存，待TMCL人員通知後再行處理。 3.
處理完成之質體必須在10μg以上，體積不超過100μl。送交DNA時必須附上電泳圖，清楚標示欲轉殖基因之片段。 4.
送交DNA時必須填寫實際之濃度，並提供可證明之資料。（如O.D. 及可定DNA濃度之電泳圖） 5.
以限制鋛酵素處理完成之DNA必須截切完全反應，否則TMCL得予以退件。 E.
每一個案將至少提供五隻帶有轉殖基因之小鼠，若同一轉殖基因要求更多之基因轉殖小鼠應視為另一個新個案。在TMCL正常之操作程序下，若因不可抗力之因素而無基因轉殖小鼠或數量不足，TMCL將重做一次，爾後結束此一個案。 F.
進行注射後五個星期，TMCL將通知申請者取回小鼠尾巴。申請人必須在一個星期內回覆並附上篩選結果，領回小鼠。
G.
TMCL不負責基因轉殖小鼠後續之代養及繁殖。 H.
所有申請時所需填之表格，均應詳細填寫。若有填寫不清之處，應予補上後才完成申請。在個案進行中需填寫之表格，亦需一一詳細填寫。共有以下表格需填寫： N0.1 Pronuclei
microinjection order form－申請時 N0.2
Prescreen confirmation form－申請時 N0.3
DNA material condition form－送交DNA時 N0.4
Tail sample release form－取回尾巴時 N0.5
Animal release form－領回動物時 I.
收費標準 1.
2.
個案開始進行時即行收費。 3. 委員會得視實際情況調整收費。
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胚胎幹細胞基因標的（ES cell gene targeting）
A. 事前準備：在申請基因轉殖實驗前，必須先瞭解以下事項。
1.
申請前已完成構築轉殖基因。
2.
已確立基因型鑑別方法，包括Long Arm端及Short
Arm端的鑑別。
3.
瞭解基因標的實驗之基本性質。例如有某些基因受其自然限制會將降低此一實驗之成功機率。 B.
TMCL使用129/SvJ or R1 品系之ES
cell。因此構築基因時必須使用同源基因來進行實驗。 C.
為維持ES
cell之品質，TMCL將使用以下之規則操作 1.每一次轉染（Transfection）TMCL使用至少6×106 ES cell。 2.欲進行實驗之DNA必須有100μg以上，體積小於400μl，且在最近兩週內製備。以單一限制鋛處理使其直線化即可。 3.基因標的實驗會因欲處理之基因、構築基因之設計、選殖基因的選擇等等因素影響。使得到正確之ES cell機率有很大的變化（從30-200倍），一般來說單一篩選藥物可以獲得200-300個以上的細胞株。因此TMCL在每一次實驗中會使用一小部分細胞用於對照組（只進行單一篩選）。 D.
在以下情況下TMCL將再進行免費之第二次實驗。 1.若第一次實驗無成功標的之細胞株。 2.第一次實驗所獲得之細胞株在100個以下，且沒有兩個以上成功標的之細胞株。TMCL將使用兩倍之細胞數（12×106）來進行第二次實驗。 除此之外，若申請者要得到更多的細胞株，將視為另一個新個案。 E.
正確的篩選結果必須在收到ES cell genome DNA後一個月回覆。 H.
所有申請時所需填之表格，均應詳細填寫。若有填寫不清之處，應予補上後才完成申請。在個案進行中需填寫之表格，亦需一一詳細填寫。共有以下表格需填寫： No.6 Gene
Targeting order form－申請時 No.2 Prescreen confirmation form－申請時 No.3
DNA material condition form－送交DNA時 No.7
ES cell genome DNA/ES cell release form－取回ES cell 或ES
cell genome DNA(gDNA)時 No.8
Screening result form－回覆結果時 G.收費： 1.
2.個案開始進行時即行收費。 3.委員會得視實際情況調整收費。
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嵌合鼠生產（Chimera production） A. 事前準備：在申請基因轉殖實驗前，必須先瞭解以下事項。 1.
申請前已鑑別成功標的之ES cell株。 2.
已找出基因型鑑別方法。 3.
有足夠的動物房空間可供嵌合鼠之配種。 4.
瞭解不是每一隻嵌合鼠都可以將標的基因遺傳給後代。 5.
申請者有義務告知TMCL其嵌合鼠是否將標的基因遺傳至後代。 B.
TMCL使用囊胚顯微注射（Blastocyst microinjection）來生產嵌合鼠，TMCL只接受由TMCL所產生之ES cell來進行顯微注射。若申請者已將ES
cell領回亦不接受。 C.
TMCL使用C57BL/6之囊胚進行實驗。 D.
TMCL以外表之毛皮顏色作為嵌合程度（Chimerism）之依據。TMCL接受的每一個案將至少給申請者六隻70﹪之公嵌合鼠。（每一個案包含兩個細胞株注射，各三隻）。 E.
若在第一次注射後發現嵌合程度不高，TMCL將通知申請者做以下兩者之一處理。 1.TMCL將進行更多之顯微注射以達到六隻70﹪之公嵌合鼠。（每一個案包含兩個細胞株注射，各三隻） 2.進行另外一個細胞株的注射。（不予收費） F.
TMCL不負責嵌合鼠後續之配種，所有嵌合鼠均需在離乳後領回。 G.
所有申請時所需填之表格，均應詳細填寫。若有填寫不清之處，應予補上後才完成申請。在個案進行中需填寫之表格，亦需一一詳細填寫。共有以下表格需填寫： No.9 Blastocyst microinjection order form－申請時 No.5 Animal release
form－領回動物時 H.
收費： 1.每一個個案包含兩個細胞株注射
2.個案開始進行時即行收費 3.委員會得視實際情況調整收費。
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胚胎冷凍（Cryopreservation） 1. 申請須知： （1） 必須已有十隻以上可供配種的公鼠（六週以上）。 （2） 小鼠族群必須無病源菌的污染。 2. 本中心使用超級排卵來獲得大量的胚胎以供冷凍，申請者應準備好適當週齡的小鼠以供使用。 3. |