2.0 藥品試劑
2.01 ”Lysis buffer”
|
Lysis buffer |
|
|
9
mol/L urea |
13.5
g |
|
4 %
(w/v) CHAPS |
1 g |
|
0.002 % Bromophenol blue*
|
50 µL (1% stock) |
|
Water,
deionised, make up to |
25 ml |
|
|
|
|
|
|
2.02
”蛋白酉每的抑制劑”-當有些蛋白酉每於urea與detergent存在下仍具有活性的情況下，可添加下列任一物質。
l
8 mmol/L PMSF-必須在添加還原劑之前，否則PMSF會失去活性。
l
40 mmol/L濃度以下的Tris base-有些蛋白酉每於高pH值或失活，但之後進行一維電泳時，需去除過多的離子。
2.03 樣品的前處理-原因與方法
l
細胞的清洗-大多用PBS清洗細胞，若是PBS殘留於細胞表面造成膠體上出現水平條紋，則可利用(10
mmol/L Tris, 250 mmol/L sucrose pH 7.0)可用來解決此問題的產生。
l
細胞破碎-不同細胞採用不同的破碎方法。
-最簡單的方法是利用滲透壓的方式即添加lysis
buffer-約5-10 x 106 cell
-細菌細胞可反覆於-20℃解凍與結凍。
-真菌與酵母菌可用清潔劑來處理較厚的細胞壁（若使用離子性的介面清潔劑，如：SDS時，但是在進行一維電泳時必須將SDS濃度降至0.1
%(w/v)
-超音波破碎或者法式壓力法。
2.04 移除過多的殘餘物
粗抽取液包含了鹽離子、磷脂質和核甘酸將會干擾電泳的條紋背景值增加因此可藉由下列方式去除：
核甘酸-由DNAse和RNAse消除，或者藉由超音波將核甘酸振碎成小分子後，再以沈澱的方式移除。
磷脂質-用界面活性劑移除。
鹽離子-沈澱或用Microdialysis的方式去除。
2.05 沈澱的方法
l
蛋白質濃度太低必須進行濃縮。
l
移除干擾物質。
l
抑制蛋白酉每的活性。
(1)Method by Damerval et al. (1986)
-植物性材料可用液態氮磨碎。
-磨碎的粉末可用10 %TCA(溶於-20℃丙酮)+0.07 % 2-mercaptoethanol。
-於冷藏櫃中進行o/n沈澱。
-之後離心並以-20℃丙酮清洗數次。
-離心並以lysis buffer復溶。
-以超音波進行破碎。
-室溫下進行離心，沈澱物溶於lysis buffer即可。
※此種方式將會造成酸性蛋白量的減少。
(2)Method by Mastro and Hall (1999)
-此方法用於脂質過多的樣品。
-可用20 % dry matter去除。
-以tri-n-butylphosphate, acetone, 和methanol的混合液於4℃下進行沈澱。
-離心並以上述相同混合液進行清洗，最後以風乾方式烘乾。
-沈澱物以lysis buffer復溶。
(3)對於非常疏水性的蛋白質-例如：膜蛋白
·
Thiourea procedure
-萃取膜蛋白非常的困難，其原因是來自於膜蛋白不容易溶於溶液中，因此以7 mol/L urea和2
mol/L thiourea和具兩性離子的界面活性劑（例如：添加ASB14或 sulfobetain）於lysis buffer中將會得到較多的蛋白。
·
SDS 方法
-使用高於2 % SDS後，必須於一維電泳前稀釋20倍後再進行。
-使用SDS的原因
（i） 防止形成oligomers。
（ii）若生物體具有非常厚的細胞壁，有時在加入1-2 %SDS後，必須加熱沸騰5分鐘。
（iii）有些非常疏水性的蛋白需用高濃度的SDS進行萃取。
-SDS最後可以2-D clean-up kit去除 。
(3)其他特定的例子
·
分析人類的體液（human body fluids）
-體液對於研究疾病標誌是一非常重要的來源
-血漿（plasma）蛋白的圖譜已被發表於Hughes et al.(1992)
-然而，大部分的體液具有非常多的蛋白及鹽離子，將會干擾一維電泳的結果，可藉由Microdialysis或在一開始進行一維電泳時以低電壓的方式進行。
·
蛋白素（albumin）
-一般而言，血清（serum）和血漿（plasma）具有非常高含量的蛋白素和球蛋白（globulin），可用blue
dextrane或sepharose Blue管柱移除蛋白素，但是許多蛋白都會與蛋白素鍵結，因此會造成蛋白的損失。
·
植物性蛋白
-植物組織特別麻煩，因為內含許多干擾物質如多醣體、核甘酸、脂質和酚類的物質，造成目標蛋白含量非常稀少，因此可用上述方法（Method
by Damerval et al.(1986)）。
2.1 操作方法
2.11血清
銀染或螢光染則直接取4 µl的量進行分析，Coomassie Blue則取8 µl的量進行分析。
2.12細胞
1. 將樣品用冰的PBS清洗三次後進行真空乾燥。
2. 烘乾的樣品以lysis buffer溶解。
3. 將樣品以超音波震盪器進行破碎 (作用10秒，停10秒，重複三次)。
4. 將細胞於20℃下，以12,000xg，離心30分鐘。
5. 收集上清液，並進行蛋白質濃度的分析。
6. 一般取100-500 µg進行分析。
2.13組織
一.經由組織均質機處理樣品
-分細胞核與細胞質(modified
from Biochem J, 2001, 360, 179-188)
操作步驟:
所有步驟須在0~4℃內進行。
1.
將樣品以 5倍體積的 ice-cold buffer A溶解
2.
離心 1,500 x g (4,000 rpm, Hettich universal 30 RF) 15 mins.
3.
(a)沉澱物:
-再復溶於
buffer B
-離心 100,000 x g (48,000 rpm,
Beckman TL-100) 60 mins.
(b)
上清液:
-離心 100,000 x g (48,000
rpm, Beckman TL-100) 60 mins
-此時所得的上清液即為細胞質的部分。
4.
用Buffer C清洗步驟3的沉澱物(a)2次
5.
離心1,000 x g (3,500 rpm, Hettich universal 30 RF) 10 mins
6.
將沉澱物以 Thiourea lysis buffer溶解之
-組織均質機磨碎 20 sec
-離心 15,000 rpm
(Hettich universal 30 RF) 15~30 mins (10℃)
-上清液則為細胞核的部分。
試劑:
Buffer A: 20mM Tris/HCl (pH7.5), 0.25M
sucrose, 1mM PMSF
Buffer B: 2.4M sucrose, 1mM MgCl2,
10 mM potassium phosphate buffer
(pH6.8), 1mM PMSF.
Buffer C: 20mM Tris/HCl (pH7.5), 0.25M
sucrose, 0.5mM MgCl2.
Thiourea lysis buffer: 2M thiourea, 7M urea, 4%
NP-40, 2% IPG buffer, 1mM PMSF, 1% DTT (PMSF and DTT are added just prior to
use)
二.或者經由冷凍切片機/雷射細胞挑選儀搭配使用雷射影像定位系統
-使用CapSure®HS LCM Caps
1.
利用雷射細胞挑選儀搭配使用雷射影像定位系統(簡稱LCM)擷取至少10,0000細胞於Caps上。
2.
若沒有立即進行蛋白質萃取動作時，可先將Caps置於乾燥的地方保存，至少可維持1個禮拜的時間。
3.
將Caps底部朝上，放置於alignment
tray內，再將ExtraSure裝置於Caps上方。
4.
將ExtraSure連同Caps裝置推進alignment
tray中。
5.
加入10~30
µL的蛋白質萃取液於ExtraSure內。
6.
準備0.5
mlMicroAmp®微量離心管，並放於CapSure HS-ExtracSure 上。
7.
將樣品置於65℃反應3小時。
8.
震盪約10-20秒，之後進行離心2500 x g，時間2分鐘。
9. 保存於-20~-70℃。