基因工程的衝擊(1999.10.25)

長庚大學基礎醫學所教授   趙清貴
中央研究院分子生物所研究員 林淑端
 
  基因工程(Genetic engineering)科技帶給人類社會極大的衝擊,堪稱是本世紀生命科學最偉大的革命。在1974年科學家稱呼這種實驗技巧為「重組DNA」(recombinant DNA)或「DNA選殖」(DNA cloning),外界則俗稱基因工程。這個基礎研究技術不僅提供了深入鑽研生命科學的利器,也積極有效地應用在醫藥和農業生產,為生物科技的實際應用開啟了光明前景。究竟是誰發明了這麼神奇的科技?它的運作原理是什麼?這樣的基礎研究為人類生活帶來什麼樣的衝擊呢?台灣的基因工程發展與前途在那裡?

1.基因工程的前哨戰

  1950年代初與1970年代初是本世紀生命科學研究最競爭、也最有斬獲的時刻:前者奠定了DNA雙鏈構造與複製的觀念,後者發明了重組DNA技術。其中重組DNA技術的問世不僅開創了生物科技的新紀元,也為人類生活帶來很大的衝擊。
  在1967年科學家就已知道DNA連接酶在染色體複製、修補時可用來接合新合成的DNA,六十年代末期麻省理工學院的Khorana與同儕也發現人工合成DNA片斷的互補端(complementary termini)可以相互靠合;1970年進一步發現細菌病毒T4核苷連接酶(T4 polynucleotide ligase)可以催化核苷酸合成DNA,把DNA平盾端 (blunt ends)共價鍵接合起來。但是,當時科學家更有興趣找個方法接合含有互補端的DNA。
  1971年R.H. Jensen 等人率先運用末端轉移酶(terminal transferase)把dA或 dT聚合核苷在試管中轉接到DNA端上;可惜這樣的氫鍵互補DNA端還是無法共價鍵接起來【註1】。1972年史丹福大學的Peter Lobban & Dale Kaiser解決了試管中無法接合氫鍵互補DNA端的問題。他們發現細菌病毒lambda外切酶(exonuclease)可以回切細菌病毒P22 DNA 5'-端而造成3'-端突出(3'-extension);他們也運用核酸外切酶III (exonuclease III)及 DNA 聚合酶I(DNA polymerase I)加強試管中兩段P22 DNA dA-dT端的接合【論文發表於1973年】。
  運用Lobban & Kaiser的發現,Paul Berg與同儕也成功地將SV40 DNA片段接到修飾過的lambda DNAldvgal上;不同的是後者接合了不同物種的DNA。但是他們擔心SV40的潛在生物危機而沒有將之殖入細菌。這樣的重組DNA因為SV40 DNA插接(insert)在ldv時,破壞了lambda病毒的複製功能,而無法在細菌中複製,因此根本當不成基因工程的載體(vector)。
  在六十年代,有關DNA合成的各樣蛋白酶實驗幾乎由史丹福大學的Arther Kornberg一手包辦,使史丹福成為DNA生化學的研究重鎮。在那樣的環境下,年輕的科學家有較好的機會快速地學習頂尖的相關知識,對敏銳如Stanley Cohen之流的天才尤其有更多的創意與機會去實現奇特的夢想。

2.天才的靈感

DNAcloning-1.gif   七十年代初期已知一些限制內切酶(restriction endonuclease)可以將DNA切開成黏突端(cohesive ends),對於連接酶將其接合成為重組DNA的效率提高很多。1972年底史丹福大學的Janet Mertz & Ron Davis,以及麻省理工學院的Khorana 實驗室成功地將這類限制酶切開的兩個DNA,藉大腸菌連接酶共價鍵接起來。比起前述T4病毒連接酶共價鍵接平盾端DNA,接合黏突端DNA顯然要有效率得多。能夠在試管中物理性接合(physical joining)兩個DNA片斷(圖一),對基因工程科技的研發是很重要的,但是這樣還不夠,尚需有辦法將重組DNA轉殖(transformation)進入寄主細胞,以及在細胞內大量製造。
  如何將重組DNA轉殖進入寄主細胞?當時並沒有人知道將重組DNA轉殖進入寄主細胞的技巧。1970年Mandel & Higa 發表細菌病毒P2及lambda的DNA可以藉感染(infection)進入細菌,這過程只要氯化鈣處理細菌即可,只可惜這方法不能使重組DNA穩定地停留在細菌裡頭。1972年史丹福大學的Stanley Cohen終於成功地將重組質體DNA(plasmid DNA)轉殖入氯化鈣處理的細菌,而且藉著質體上的抗生素(如鏈黴素)標記建構細菌株,可以穩定地繁殖質體DNA。這樣的技術可以選殖(cloning)特定標記的質體DNA,也可以選殖插接在質體DNA複製系統的任何DNA片斷,甚至用來研究DNA片斷上的遺傳訊息(如基因重組)及DNA構造。選用高倍套數的質體DNA還可以在細菌內大量製造重組DNA。因此Cohen的創意是巧妙地運用了細菌質體遺傳學的經驗。
  1972年十一月,Cohen在夏威夷舉辦的「美日細菌質體研討會」中發表質體DNA的轉殖技術。他在會報中聽到加州大學舊金山醫學院的生化學家Herbert Boyer報告:限制內切酶EcoRI【註2】可以將DNA端切出外突的單鏈DNA。他突發的靈感:這種帶黏突端的DNA或許可以用來重建質體DNA,也可以把其他物種DNA片斷接到質體複製系統。既然質體DNA的轉殖技術不成問題,或許可以利用質體複製子(replicon)選殖無法複製的外來DNA片斷。於是Cohen向Boyer提議合作試驗這樣的構想。不過主要的憂慮是EcoRI能否在質體上只切一次,以方便插接外來DNA,而且不會傷到複製子與抗生素標記的功能。在當時根本沒有人知道這樣絕妙而直截了當的夢想是否可以創造具生理功能的DNA分子。兩人在Waikiki海濱的濬智交談已然深夜,在坐共享天才美夢與醇酒甜點的還有知名的細菌病理學家Stanley Falkow等。

3.第一個重組DNA

DNAcloning-2.gif   基因工程科技包括四個層面:如何將不同的兩個DNA物理性接合?如何將重組DNA轉殖進入寄主細胞?如何運用寄主細胞大量製造重組DNA?以及如何辨識帶有重組DNA的寄主細胞?而首先突破物種疆界且具備載體功能的重組DNA正是由Cohen 與Boyer合作完成(圖二)。
  夏威夷研討會之後,Cohen 與Boyer【註3】兩人的合作研究隨即展開。1973年三月,實驗結果顯示這樣的DNA選殖設計是可行的。當時的實驗是利用EcoRI將100-kb的抗生素質體R6-5切割成十一個DNA片斷,處以連接酶之後DNA被轉殖進入細菌,保留有複製子及抗生素指標基因的各式重組質體DNA最後被選殖出來了。其中有的質體只帶有短短的複製子片斷及單一抗生素指標基因即足夠進行選殖。這個實驗結果清楚地證明了:無法複製的外來質體DNA片斷接到另一個具複製功能的質體DNA上,可以利用其一複製功能及另一抗生素功能在細菌中大量繁殖。理想的載體DNA應該含有複製功能、抗生素指標基因,以及一種限制內切酶即可切割的選殖區。在Cohen手中的9 kb質體pSC101【pSC是plasmid Stanley Cohen的簡寫】就是理想中的載體!當時尚無DNA定序技術,這樣的選殖設計必需有高度想像及理智。pSC101帶有tetracycline抗生素指標基因,EcoRI 切成線性的pSC101可以接上同樣限制內切酶切成的kanamycin質體DNA片斷,處以連接酶之後DNA被轉殖進入大腸菌,再用tetracycline 及kanamycin雙重抗生素篩選。史丹福這邊完成這一切工作之後,隨即送去舊金山;Boyer研究室的電泳膠生化分析證明:重組DNA確實攜帶預期的兩種質體DNA組合。
  全世界第一個具選殖功能的重組DNA經典實驗終於在1973年五月撰寫成稿,由加州理工學院的Norman Davison院士推薦發表,刊登在十一月的「美國科學院彙報」。

4.基因工程的禁忌

  七十年代初期,科學家意圖進行基因選殖的研究。即使技術都還沒有,就有人擔心腫瘤病毒DNA在大腸菌中繁殖的安全問題。
  因為當年已經知道動物DNA當中含帶有潛伏性RNA腫瘤病毒的基因序列。自然會憂慮:操作這樣的DNA是否會導致癌症?是否所有脊椎動物的DNA試驗都有潛在危機?可是一時也沒有共識,倒是科學家們一致認為這類實驗應該適度規範,以免誤陷軍事用途。當時還是生化系研究生的Janet Mertz,在參加1972年美國東岸一個冷泉港學術會議時透露:西岸的科學家正在從事重組DNA的實驗,而且有證據顯示這種人工生物是有活性的。這消息可震驚了學界,也即刻引起政界與媒體的注意。
  1973年史丹福大學正式宣佈EcoRI-pSC101重組DNA的試驗成功,讓一些科學家更憂慮,經過媒體炒作也驚動了學界以外的人士。較激進的反科學人士甚至以神的權杖來擋駕科研。基因工程是否要繼續發展?要如何制定合理的規範來約束潛在危害生命的實驗?一時之間,基因工程成了本世紀生命科學研究最受爭議的話題。
  1974年七月,包括Cohen及多位諾貝爾獎得主的一群主流科學家在「科學」刊登重組DNA試驗的潛在危機,呼籲所有涉及重組DNA的試驗應該暫停。1975年二月,來自世界各地的一百多位科學家、律師與媒體記者聚集加州Monterey海岸的Asilomar會議中心,討論重組DNA試驗的生物危機及可能涉及的倫理、法律問題,商議的結果一致認為:DNA選殖只能使用試管中才能存活的實驗細菌株進行。1976年七月,美國衛生署官方版規範正式出爐,嚴格禁止一切涉及致癌基因的重組DNA研究,歐洲國家隨後也製定了類似的管理規範。基因工程的任何研究進退兩難,頓時陷入停擺狀態。

5.基因工程的潛力

  第一個重組DNA問世之後,基因工程科技隨即被Cohen及同儕進一步用來證明:大腸菌質體DNA可在大腸菌中選殖葡萄球菌DNA(刊登在次年四月的美國科學院彙報)。除了選殖細菌DNA,這套基因工程科技也被這些科學家用來選殖非洲牛蛙的核糖體RNA基因,並且將這真核細胞DNA在大腸菌中表現(刊登在1994年五月的美國科學院彙報)。
  基因工程的重要在於開啟了病毒、細菌、植物及動物等DNA研究的可能性。雖然利用細菌病毒選殖及分析細菌DNA的技術相當成熟,可是沒有人有經驗建構動物病毒來選殖及分析染色體DNA,像是血紅素及肌肉蛋白的基因。因為重組DNA的技術可以用來從事這方面的研究,譬如散彈槍選殖(shotgun cloning)就是用限制內切酶切割出成千上萬的人類DNA片斷,插接在細菌質體上,再進一步找到攜帶特定人類基因的細菌株。因為篩選像血紅素訊息RNA的技巧已可建立,找到正確基因應該不成問題;對於其他各式各樣基因的構造與功能的探討,也可以運用基因工程方便地來進行。
  用傳統方法養殖腫瘤病毒會讓科學家擔心罹患癌症的危險。其實實驗室常用的選殖用腫瘤毒病SV40與非腫瘤的人類一般病毒很像,得病的機率相當小;儘管如此,工作人員還是會擔心。因此病毒學家也可以運用基因工程的技術來大量製備病毒DNA。
  1976年的美國衛生署規範非常嚴厲,有些甚至不合理。但是越是經歷長期多次試驗,科學家越是發現重組DNA的危險性非常低。1978年的深入討論,美國決定放寬限制,次年一月正式准許選殖病毒致癌基因。從此重組DNA的適用範圍更廣,包括任何剪接DNA、RNA的實驗。各式各樣領域的生物學家爭相使用這個多才多藝的尖端科技來研究廣泛的生命現象,從基因表現的調控到演化都有。「生物科技」就是利用重組DNA研製各種醫藥、疫苗的新興工業。1980年之後,人類遺傳學的知識累積之快,比起之前簡直是天壤之別。1980年代中期,PCR(polymerase chain reaction)技術的問世與基因工程相輔相成,把生物科技的威力更加提升。

6.台灣的基因工程夢

  美國科學家在七十年代初期發明基因工程科技,為了避免無法掌控的新物種出現,政、學界於中期引發劇烈地討論,雖然延誤了幾年的研究,但七十年代後期開始較蓬勃、普及至歐美各研究單位。1982年,台北中央研究院一場哈佛、康乃爾、約翰霍浦金斯大學的海外華人大聚會,為台灣開始引進這項新生物科技,也開啟了台灣這一方面的學術研究風氣。
  十五年多過去了,讓我們撿視一下台灣在基因工程方面的進展。中央研究院分子生物所為首的基礎研究已有很突出的成績,有少數成果甚至可以擠入國際一流水準。而其衍生出來的周邊效應也讓一些大學校園的研究程度上升了。整體而言,台灣的基因工程推廣確實影響了基礎科學的研究;但是在應用方面則始終看不出具體的成績。
  1980年美國首度授權史丹福大學基因工程專利執照,隨後被許多生物科技公司用來生產重要的的醫療用藥如荷爾蒙、酵素、干擾素等。生物科技公司最成功的例子是Genentech。基礎科技的市場利益吸引象牙塔裡的學者,相繼出走自創或與生技公司掛鉤: Boyer 是Genentech生物科技公司的創始人。Kornberg學派及Charles Yanofsky則是仙靈公司旗下DNAX的後台股東。近二十年來的經驗顯示,基因工程科技確實能夠提升人類的生活品質,它也有賺錢的潛力,但是並非生物科技公司都能盈利。基因工程大師Cohen堪稱是「生物科技之父」,他非常善長辨識有實用價值的研究,並將其成果申請專利。也使得史丹福大學的生物科技專利申請成為全世界仿傚的模式。
  台灣政府近年來也較積極地發展生物科技,希望有本土成就的生物科技專利,可惜台灣基因工程夢的發展有如在流沙上蓋大樓。運用國外研發好的技術用在不同學門領域的研究比較容易,但是創新的本土生物科技則必需有良好的基礎研究。如果像拾破爛般移轉國外研發好的片斷技術,意圖以移花接木的手法包裝,只怕是欺人自欺,很難會有自己招牌的生物科技。即使像史丹福大學這麼頂尖的生物科技專利高手,目前也只有第一張基因工程專利是賺大錢的。我們應該一切腳踏實地從基礎做起,忌諱投機才真正有機會發展出本土的生物科技,實現台灣的基因工程夢。(原載「科學月刊」二十卷十二期,1999)

參考文獻

一般文獻

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註釋

  1. 因為少了連接酶;後來史丹福的Hogness實驗室證明:只要將這樣的DNA送入細菌內就可以把其氫鍵互補端接合起來。
  2. Eco是大腸菌Escherichia coli的縮寫,RI是細菌品系。
  3. Cohen與Boyer是最早完整地實驗陳述重組DNA技術的人,是學界公認重組DNA技術的創始人。因為提出DNA構造與複製的觀念而榮獲1962年諾貝爾獎的James Watson也公開承認:重組DNA技術的最大貢獻非Cohen與 Boyer莫屬。