生物反應器在組織工程中所扮演的角色

生化生醫所 劉繼賢助理教授

化材所 盧勁汎研究生

一、摘要

  體外培養之組織的工程技術是一個快速發展的領域,並影響眾多醫療的應用。技術的障礙存在於對組織發育的生理生化與培養條件參數了解不足以及昂貴的培養成本。然而,藉由可控制並維持特殊環境的生物反應器,使得在體外三維環境中所培養之組織可以表現活體組織的生理功能,進而改善體外培養組織之品質。如何有效將細胞接種於多孔性三維骨架 ( scaffold ),增加物質傳遞的效率,並提供體外組織的機械刺激,也是生物反應器開發時要考慮的要件!除此之外,藉由自動化及標準化之體外組織培養之密閉系統,生物反應器可降低生產成本,使體外培養之組織可以廣泛又有效被應用於再生醫療。

二、細胞接種於三維骨架

  對於細胞骨架的接種來說,為將分離的細胞散布置於骨架中,首要的目的即建立三維的培養體系,此系統的建立,對於組織生成的進展,將扮演一個重要的角色。一般來說,細胞能均勻的接種於骨架上將使得組織的生成能均勻分布,然而,就實際上而言,即使一個小的骨架 ( 如直徑5mm ×寬2mm ),欲使高密度的細胞均勻且有效的分佈於整個骨架上,仍然是一個相當大的挑戰。之前常用的接種方法為將細胞靜態接種於骨架上,研究顯示此方法接種效率低、細胞分布不均、骨架周邊缺乏細胞以及接種的效果應操作的方式或因人而有所差異。為了改善此缺點,有人利用攪拌瓶反應器 ( Spinner flask ) ( 1 a ),將骨架置於其中,藉由攪拌產生對流使得懸浮細胞流入骨架中,相較於上述方法,此法可提升接種效率以及細胞的分佈。然而,利用攪拌瓶反應器接種細胞時,由於流體的對流無法進入骨架內部,這將導致整體接種效率下降以及使得骨架表面細胞密度較高而分布不均。研究也顯示,如果利用對流將細胞放入骨架的原理,相較於靜態及攪拌瓶的接種方式,三維骨架的接種可使用直接流灌法及結合自動化的生物反應器來更有效及更均勻的接種細胞。此外,流灌式的接種也可與流灌式反應器 ( 1 d )整合在一起,不但能有效的接種細胞,也能同步進行組織培養。此系統的建立,不但使工程組織製程更有效率,也對於組織與反應器之間的處理與轉移的風險降低。

三、增加物質傳遞的效率

  長久以來,體外三維組織培養的氧氣以及可溶性養分的提供,一直是極重要的限制因素。早期的研究顯示,當組織團塊直徑超過1mm其組織內部即產生組織缺氧和壞死的現象,只有周邊的組織保有活細胞。然而,就工程組織來說,組織置換所需的移植體其大小必須至少數公厘以上,因此,質傳的限制為一極大的挑戰。

  有研究分別比較靜態培養、攪拌瓶培養以及旋轉壁式培養對於軟骨組織生長的影響,靜態培養的結果顯示組織內部由於質傳效率不佳導致組織發育不良 ( 2 a );而攪拌瓶培養 ( 1 a )的結果顯示,相較靜態培養組織內部質傳效率有提升,不過組織周邊由於質傳的邊界濃度效應,導致組織周邊生長不佳 ( 2 b );為了改善上述兩者的缺點,旋轉壁式培養反應器 ( 1 b )被開發出來,藉由流體迴轉的環境,它可以產生動態的層流,有效的降低養分及廢棄物擴散的限制並產生較少的剪應力,此實驗結果顯示軟骨組織生長發育佳,其組織生化及生醫特性皆優於靜態培養及攪拌瓶培養 ( 2 c )。此結果顯示,旋轉壁式生物反應器對於工程組織的發展甚重,也對於體外器官系統模式提供一個很好的方向。

 

圖2 靜態培養、攪拌瓶培養以及旋轉壁式培養對於軟骨組織生長的影響 ( 1 )( a ) 靜態培養,組織內部由於質傳效率不佳,導致組織發育不良。( b ) 攪拌瓶反應器,可藉由對流傳輸的方式將培養液質傳入骨架中,但邊界有亂流效應,導致組織周邊生長不佳。( c ) 旋轉壁式反應器,可提供一個低剪應力及高質傳的環境,顯示軟骨組織生長發育佳。Bar 代表 1 mm。軟骨組織中的 醣胺多醣 ( Glycosaminoglycans, GAG ) 被染成紅色 。GAG 越多代表軟骨組織生長越佳。

  針對一些具高度代謝性功能的細胞,有研究者開發一種生物反應器,即利用流灌的方式將培養液直接或由周邊流經半透性的中空纖維膜 ( 1 c ),具有增加養分及氧氣的質傳效果。這種流灌的培養方式,對於工程組織來說,培養液直接流經已接種細胞的多孔性三維骨架 ( 1 d ),可充分改善骨架周邊及內部孔洞的質傳限制。若將此方法結合到生物反應器的設計上,將可提升細胞的存活、生長以及功能。

  將特殊的機械力應用於三維的細胞結構不僅對於工程組織發展有幫助,對於一些多效性的幹細胞具有促進直接分化的效果。然而特定的機械力 ( 如大小、頻率、連續、間斷、循環 ) 是刺激部分組織的;此外,不同發展階段的工程組織可能需要不同的機械條件以增加細胞外基質的累積以及結構組織的發展。對於這種情況,生物反應器可以扮演一個重要的角色,不但提供一個再生的控制環境,更可以確立特定機械力對於三維結構的應用。 ( 1 e )生物反應器對於機械力應用於三維結構來說,可使得傳統加強細胞分化或是細胞外部基質沉澱於工程組織的方法之應用層面更廣。此外,數量上的分析、電腦化的應力模式再加上一般體內組織的活性和生物反應器中的工程組織,可使得我們可以更精確的比較體內及體外的機械條件,也可以幫助我們了解物理復原的條件,將使得組織更適於為病患所接受。

四、組織移植體的製造

  為了恢復受傷或生病組織的外部體內組織工程以細胞為培植體,擁有相當大的潛力,對於一些嚴苛無效的物理治療階段和生活品質的改善將引起革命。然而,目前主要的挑戰為如何將實驗室研究規模的生產模式放大到適用於臨床效益和經濟可接受的狀態,且如何符合 GTP ( 圖Good Tissue Practice ) 的規定也是必要的。創新生物反應器系統的發展,對於細胞組織工程的臨床試驗也是極重要的。Advanced Tissue Sciences ( ATS ) 公司使用生物反應器來大規模生產組織工程產品 DermagraftR。此自動化系統,於細胞增生時期可自動更換培養液,且這套封閉生物反應器系統可接種及培養96張組織工程的皮膚移植體,並可自動流灌培養液。儘管如此,這套系統仍有一些缺點,如控制不佳以及產生一些有缺陷的產品,使得整體生產成本提高。

  先進的控制系統促進生物反應器生產體外組織之程序自動化及快速發展。如 Millenium Biologix 公司即結合 OSTEOTM 生物反應器系統以及 ACTEXTM 控制系統,開發一套有效的先進臨床組織培養系統。首先是病患的組織檢測及取樣,再藉由生物反應器系統來分離細胞、使細胞生長、接種特定細胞型態於骨架上、於適當的環境下培養使生成一適當的移植體,這些不同的階段過程可以直接於同一封閉系統下自動執行 ( 3 )。這個系統的建立對於很多病患來說無疑是一大福音,不但病患可以擁有自體自源的組織,也降低了移植的許多爭議問題。這個系統也將減少龐大且昂貴的 GTP 組織製造問題及減少操作手續。

▲圖3 自動化生產組織移植體的流程圖(a)醫生取得病患的檢體,並將組織分離出來置於反應器中。(b)培養液、骨架及一些用品於適當的溫度下保存。(c)系統可自動的分離正確細胞。(d)正確的細胞於生化反應器中增生。(e)將細胞均勻接種至骨架上。(f)於適當的條件下培養,使其成為一移植體。(g)培養環境的參數,及組織的生長狀況可直接輸入電腦分析並監測。(h)由病歷中收集組織培養的相關資料,輸入電腦。(i)電腦整合後,提供最佳的組織培養參數進行培養。(j)電腦提供病人的組織培養與組織發育等資訊給臨床醫師,最後由醫師將移植體植入病患中。

五、結論

  生物反應器可以提供精密的監控系統和製程,適用於體外培養三維組織,使我們更容易進行特定生物、化學或物理因素對於體外組織之功能研究。然而如果要從實驗室規模進展到工業量產規模,生物反應器轉必須要由高度彈性用途,轉換成一特定用途的生物反應器,以實現標準化的生產製程。這些進展也讓體外三維組織的製造走向經濟且自動化的方向,未來臨床上大規模的體外組織生產是可預期的。

六、參考文獻

  Ivan Martin, David Wendt and Michael Heberer ( 2004 ) Review:The role of bioreactors in tissue engineering. Trends in biotechnology. 22, 80-86


 
45期校訊